Laboratorio Cassara
COVID-19 NEOKIT-TECNOAMI es un test diagnóstico para la detección molecular simplificada del virus SARS-CoV-2, agente etiológico de la neumonía atípica o Síndrome Respiratorio Agudo Grave COVID-19.

Descripción del principio de acción:

El método de detección de COVID-19 se basa en la retrotranscripción del genoma del SARS-CoV-2 (ARN) seguida de una amplificación molecular específica de cuatro fragmentos del ADN resultante, a partir del ARN aislado de la muestra clínica (hisopado nasofaríngeo / orofaríngeo, saliva o esputo).

La síntesis de un ADNc (retrotranscripción) seguida de la amplificación específica del fragmento (amplificación molecular isotérmica) ocurren a temperatura constante (64°C), en un único paso operativo. El resultado se revela a través de un simple cambio.

En la mezcla de reacción se encuentra presente el Azul de hidroxinaftol (Hydroxynaphthol blue - HNB), un colorante indicador que vira de color violeta a color azul cuando la reacción de amplificación es positiva. Dicho viraje, se debe al cambio de concentración del Mg2+ libre en solución conforme disminuyen los dNTPs y aumenta el pirofosfato producto de la polimerización.

Especificidad:

Inclusividad
Este kit fue desarrollado para detectar COVID-19 y el diseño de sus cebadores se realizó mediante un análisis exhaustivo por comparación de las secuencias de SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) proveniente de Wuhan, China y otras 10 secuencias más del virus obtenidas de GenBank, que corresponden a China, Japón y USA, que incluyen las secuencias de los virus circulantes en Argentina.

Se definió el uso de cuatro juegos de cebadores (genes ORF 1Aa y 1Ab, E y N) que presentan 100% de homología con la secuencia de los genomas evaluados de SARS-Cov-2.

Exclusividad

Se realizó un exhaustivo análisis in silico de comparación de secuencias, donde se incluyeron otros coronavirus: SARS (NC_004718.3), MERS (NC_019843.3), Bat-SARS (MG772846) y virus de diferente género: PDCoV (KX022605.1), TGEV (NC_038861.1) y PEDV(NC_003436.1). Además, se incluyeron los genomas de virus de concomitancia regional como Dengue (cuatro serotipos), Zika, Chikungunya, Influenza (H1N1), y genomas de potenciales contaminantes de la muestra, como levaduras, bacterias y humano.

A través de este estudio, se confirmó que las secuencias de los cebadores seleccionados en este kit son específicas e inequívocas para la detección de SARS-CoV-2, por lo que no se esperan reacciones cruzadas (falsos positivos) ni de interferencia (falsos negativos).
Asimismo, se realizaron ensayos de especificidad in vitro con múltiples genomas, incluyendo humano, de levaduras, bacterias y virus regionalmente concomitantes (Influenza, Dengue, Zika y Chikungunya), confirmando que el kit es específico para SARS-CoV-2.

PRECISIÓN y sensibilidad analítica

Se realizó un ensayo con una muestra de referencia de ARN purificado de SARS-CoV-2, con tres operarios en tres días diferentes. La reproducibilidad analítica (repetitividad) fue adecuada, obteniéndose con 12,5 copias de genoma viral un resultado positivo en el 100% de los casos ensayados. Con una dilución al medio, 6,25 copias de genoma viral, los estudios funcionaron bien en la mayoría de los casos (80%), conservándose la proporcionalidad con diluciones menores.

Teniendo en cuenta los resultados de sensibilidad y de repetitividad, se estableció que el límite de sensibilidad del kit es 12,5 copias del genoma viral.

El método es preciso ya que todos los resultados por encima del límite de sensibilidad definido son coincidentes en el 100% de los casos.

Interferencias

Datos experimentales y bibliográficos indican que no hay interferencias en los resultados obtenidos con el kit. Los principales contaminantes factibles de ser encontrados en las muestras, como células y ADN humano, levaduras (Saccharomyces cerevisiae) u otros microorganismos, no dan reacción cruzada con el kit.

Referencias bibliográficas:
1- Informe SARS-CoV-2 de Sociedad Argentina de Virología, División de la asociación Argentina de Microbiología, 26 de Marzo 2020 (1-31) 2-Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28 (12):E63 3- World Health Organization. Coronavirus disease (COVID-19) Situation dashboard. World Health Organization website. https://who.sprinklr.com/. Accessed 17 April, 2020. 4- Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K (2009) Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques 46(3):167–172 5- Bhadra, S., Jiang, Y.S., Kumar, M.R., Johnson, R.F., Hensley, L.E., Ellington, A.D., 2015. Real-time sequence-validated loop-mediated isothermal amplification assays for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). PLoS One 10, e0123126.

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Preguntas Frecuentes NEOKIT COVID-19

Cómo funciona el test?

El método de detección de COVID-19 se basa en la retrotranscripción del genoma viral del SARS-CoV-2 seguida de una amplificación molecular del ADN resultante, a partir del ARN aislado de la muestra clínica (hisopado nasofaríngeo, orofaríngeo, saliva o esputo). Ambas reacciones ocurren a temperatura constante (64⁰C) en un único paso operativo y producen un viraje de color violeta a color azul cuando la reacción de amplificación es positiva.

Cuáles son las ventajas respecto a la PCR convencional?

La rapidez del resultado (menos de dos horas desde la toma de la muestra) y su simpleza permiten obtener un diagnostico en el lugar, ya sea al pie de cama o en la búsqueda de casos positivos en zonas de alto nivel de contagio, permitiendo así un control más efectivo de la pandemia.

Cuál es el equipamiento necesario para realizar el test?

Una centrífuga pequeña y un bloque térmico, equipos accesibles y disponibles en el mercado

Es preciso contar con área de bioseguridad para realizar el test?

No es necesario contar con un área de bioseguridad, así como tampoco una cabina especial cuando la muestra es analizada en el momento. Es necesario que la persona que realiza el hisopado tenga los elementos de protección personal adecuados, una vez obtenida la muestra se inactiva inmediatamente en solución de lisis. Se recomienda que el test se realice en una sala distinta a la de toma de muestras para evitar contaminación cruzada de la muestra.

Cuál es la sensibilidad del test?

Los estudios han demostrado que el test tiene una sensibilidad analítica del 100% partiendo de muestra que contenga apenas 12 copias de genoma viral. La sensibilidad clínica evaluada contra muestras clínicas diagnosticadas en centros de referencia es del 98%.

Cuál es la especificidad del test?

Las secuencias de los cebadores seleccionados en este kit son específicas e inequívocas para la detección de SARS-CoV-2, por lo que no se esperan reacciones cruzadas (falsos positivos) ni de interferencia (falsos negativos). Asimismo, se realizaron ensayos de especificidad in vitro con múltiples genomas, incluyendo humano, de levaduras, bacterias y virus regionalmente concomitantes (Influenza, Dengue, Zika y Chikungunya), confirmando que el kit es específico para SARS-CoV-2.

Cómo fue desarrollado el test?

El test fue desarrollado por los científicos argentinos Adrian Vojnov, Carolina Carrillo, Santiago Werbajh, Luciana Larocca y Fabiana Stolowicz con lugar de trabajo en el Centro Milstein (Conicet-Fundación Pablo Cassará). El grupo de investigadores se encontraba trabajando en el desarrollo de un test similar para dengue y cuando comenzó la pandemia rápidamente reorientó el foco hacia el COVID, permitiéndoles con al apoyo del Ministerio de Ciencia y Tecnología desarrollar el test en apenas 60 días. Durante su desarrollo el test fue validado con muestras clínicas de la Institución de referencia ANLIS-Malbran, y evaluado luego por la autoridad sanitaria ANMAT quien finalmente otorgó el registro de comercialización el día 15 de mayo de 2020.

Es preciso contar con área de bioseguridad para realizar el test?

No es necesario contar con un área de bioseguridad, así como tampoco una cabina especial cuando la muestra es analizada en el momento. Es necesario que la persona que realiza el hisopado tenga los elementos de protección personal adecuados, una vez obtenida la muestra se inactiva inmediatamente en solución de lisis. Se recomienda que el test se realice en una sala distinta a la de toma de muestras para evitar contaminación cruzada de la muestra.

Dónde se produce el test?

El test se produce en Argentina a partir de insumos nacionales e importados.

Cuál es la capacidad de producción del test?

Si bien la capacidad de producción es suficiente para atender la demanda sanitaria de Argentina y los países de la región, es necesario planificar la demanda de grandes cantidades con cierta anticipación ya que en estos casos el tiempo de entrega puede ser de hasta 60 días.

Dónde serán utilizados los primeros test?

El aprovechamiento sanitario de esta herramienta será coordinado con las autoridades de salud, entendiendo que actualmente la prioridad es en los barrios populares donde el nivel de contagio actual es muy alto.

Tiene sentido testear a toda la población?

Si bien en términos económicos el costo de testear a toda la población es despreciable en relación al costo de mantener una cuarentena prolongada, en términos sanitarios no está demostrado que esta estrategia sea 100% efectiva. La estrategia sanitaria que aparenta tener más sentido al momento es continuar con el testeo de casos sospechoso y sumar el testeo en forma inmediata a todo contacto estrecho de caso confirmado, independientemente de la presencia de síntomas.

Cómo se puede aprovechar mejor el test para los casos de mayor riesgo de contagio?

En casos particulares como el personal de salud que está en contacto frecuente con pacientes diagnosticados positivos, probablemente sea útil realizar testeos en forma sistemática y frecuente independientemente de la aparición de síntomas.

Además de su utilidad sanitaria en el control de la pandemia, qué otra utilidad tiene el test?

Además de su utilidad sanitaria, el test permitiría modificar los protocolos actuales de situaciones particulares como el futbol profesional, los vuelos internacionales y varias otras de alto impacto económico y social.

Ante cualquier duda puede comunicarse a NEOKIT S.A.S. - info@neokit.com.ar -

NEOKIT S.A.S.
Saladillo 2452
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Argentina
Teléfono: (011) 4105-4100
DT: Farmacéutico Sergio Pallotto
Autorizado por el ANMAT
Registro N° PM 2576-01
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